影響兔ELISA試劑盒實驗的因素

　　兔ELISA試劑盒主要由包括試劑盒盒體、酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、懈氏試劑、緩沖液、洗滌液、顯色劑和停止劑等組成。試劑盒的盒體上標(biāo)有試劑盒編號、試劑名稱、制造商等基本信息，用于方便用戶識別和區(qū)分不同試劑盒。
 
　　酶標(biāo)板是試劑盒中的核心部件，通常采用96孔板的形式，每一孔都涂有特定的抗原、抗體或其它蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品是與待檢樣品相同或類似的蛋白質(zhì)，用來檢測和定量待測樣品中的抗體或抗原。樣品是待測標(biāo)本，可以是免疫學(xué)實驗室中的兔血清，也可以是其它液體、組織、細胞等。
 
　　免疫酶標(biāo)法的原理是將待測樣品加到涂有抗原或抗體的酶標(biāo)板中，通過特異性反應(yīng)將待測物質(zhì)捕獲在酶標(biāo)板上；然后加入可與待測物質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記物，如酶、金標(biāo)等，使其與被捕獲的物質(zhì)產(chǎn)生特異性結(jié)合；加入顯色底物如TMB，用于檢測標(biāo)記物的酶活性，產(chǎn)生顏色變化。液體樣品從血漿、血清或其它生物樣品中分離出來，加到酶標(biāo)板中，與涂有同種或異種來源的抗原或抗體結(jié)合，用酶標(biāo)法檢測其是否含有特異性免疫球蛋白、抗體等。
 
　　在試劑盒中，常用的酶標(biāo)法包括直接法、間接法、競爭法、夾心法等。在直接法中，樣品直接與定量抗原或抗體反應(yīng)；在間接法中，用兔血清中特異性抗體與抗原反應(yīng)，然后用特異性標(biāo)記分子如HRP等檢驗抗原特異性的抗體；在競爭法中，添加適當(dāng)濃度的特異性抗體、酶標(biāo)記的抗原及待測物競爭反應(yīng)，以判斷待測物在樣品中的存在量；在夾心法中，兔抗體與特定抗原反應(yīng)后，用兔抗體和酶標(biāo)記的抗兔IgG標(biāo)記。
 
　　兔ELISA試劑盒實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認真負責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。我們技術(shù)人員通過幾年的實驗觀察，認為影響ELISA實驗的因素有如下三方面。
 
　　一、、抗原、抗體活性對效價的影響：
 
　　主要是試劑中抗體(或抗原)的效價降低或失活，結(jié)果不易判斷。再有ELISA試劑盒靈敏度高，對雜質(zhì)的反應(yīng)靈敏度也高，實驗中空白對照OD值偏高或假陽性；酶結(jié)合物濃度過高，也會導(dǎo)致OD值假性增高。試劑保存不當(dāng)或活性下降；試劑盒靈敏度高。
 
　　二、、試驗儀器：
 
　　1、加樣器是否經(jīng)過校正，酶免測定血清用血量很少，如手工加樣器的性能不好，吸取樣品不，會使結(jié)果忽高忽低。
 
　　2、實驗器具被污染；酶標(biāo)滴加在孔壁上，洗板未洗凈；混用洗液或洗液稀釋錯誤；洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌；讀數(shù)時酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)；洗液瓶、廢液瓶混用；讀數(shù)過程中板孔中有氣泡；酶標(biāo)儀偏差均可引起假陽性結(jié)果。
 
　　三、操作：
 
　　1、檢測前先將兔ELISA試劑盒從冰箱取出置室溫平衡20min后使用，試劑用完及時放回冰箱冷藏，以免造成試驗結(jié)果假性降低；孵育溫度過低；
 
　　2、抗原與抗體反應(yīng)達到平衡，依賴于溫度與時間。溫度高于45℃易引起失活及標(biāo)記物脫落，溫度低于4℃，影響反應(yīng)速度。
 
　　3、加入標(biāo)本后未進行必要的混勻；標(biāo)本稀釋錯誤；加樣量不正確；冷凍標(biāo)本未溶解混勻；標(biāo)本中含有防腐劑均可引起陽性對照讀數(shù)不正常。
 
　　簡而言之，由于兔ELISA試劑盒實驗的影響因素較多，在實際工作中操作規(guī)范、仔細，避免和排除各種因素的影響，使之得到準(zhǔn)確可靠的檢驗結(jié)果。